Metabolomanalyse zur Untersuchung der Dynamik im Aromatenbiosyntheseweg in L-Phenylalanin Produzenten von $\textit{Escherichia coli}$
Metabolomanalyse zur Untersuchung der Dynamik im Aromatenbiosyntheseweg in L-Phenylalanin Produzenten von $\textit{Escherichia coli}$
Am Beispiel der Aromatenbiosynthese in $\textit{E. coli}$ wurde das Prinzip des $\textit{metabolic profiling}$ erstmalig auf einen anabolen Stoffwechselweg in rekombinanten Produktionsstämmen (L–Phe Produzenten) angewendet. Dazu wurde die Technik der Glukosepulsexperimente mit schneller Probenahme u...
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Personal Name(s): | Oldiges, Marco (Corresponding author) |
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Contributing Institute: |
Biotechnologie; IBG-1 Biotechnologie 2; IBT-2 |
Imprint: |
Jülich
Forschungszentrum Jülich GmbH Zentralbibliothek, Verlag
2005
|
Physical Description: |
XVI, 181 S. |
Dissertation Note: |
Universität Bonn, Diss., 2004 |
ISBN: |
3-89336-380-7 |
Document Type: |
Book |
Research Program: |
ohne Topic |
Series Title: |
Schriften des Forschungszentrums Jülich. Reihe Lebenswissenschaften / Life Sciences
11 |
Link: |
OpenAccess |
Publikationsportal JuSER |
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520 | |a Am Beispiel der Aromatenbiosynthese in $\textit{E. coli}$ wurde das Prinzip des $\textit{metabolic profiling}$ erstmalig auf einen anabolen Stoffwechselweg in rekombinanten Produktionsstämmen (L–Phe Produzenten) angewendet. Dazu wurde die Technik der Glukosepulsexperimente mit schneller Probenahme unter Verwendung von rekombinanten $\textit{E. coli}$ L–Phe Produzenten durchgeführt und das dynamische Signal der intrazellulären Metabolitkonzentrationen im Verlauf des Pulsexperimentes mittels einer neu entwickelten LC–MS Technik verfolgt. Die Pulsexperimente wurden im Fed–Batch Verfahren unter produktionsrelevanten Bedingungen durchgeführt, so dass die Ergebnisse Rückschlüsse auf den Produktionsprozess zulassen konnten. Die Stimulation des Stoffwechsels durch den Glukosepuls konnte dabei nicht nur im katabolen Stoffwechsel (Glykolyse, Pentose–Phosphat–Weg), sondern auch in Metaboliten der Aromatenbiosynthese auf dem Weg zum L–Phe nachgewiesen werden. Die bisher auf den Zentralstoffwechsel in Wildtyporganismen beschränkte Methodik der Glukosepulsexperimente konnte erstmals auch zur Beobachtung der Metabolit–Dynamiken in einem anabolen Stoffwechselweg eines rekombinanten $\textit{E. coli}$ Produzenten angewendet werden. $\bullet$ Es wurde eine quantitative $^{1}$H–NMR Methode etabliert, um die Metaboliten der L–Phe Biosynthese in Fermentationsproben nachzuweisen. Die Methode erlaubte quantitative Metabolitmessungen, auch wenn kein Standard verfügbar war. Die in der Literatur zugänglichen $^{1}$H–NMR Spektren der Metaboliten erlaubten die qualitative Identifizierung der Metaboliten, die Quantifizierung erfolgte unter Verwendung eines internen Standards. Da nicht alle 11 Metaboliten der Aromatenbiosynthese (von den ersten 7 Metaboliten sogar nur einer) kommerziell verfügbar waren, zeichnete sich diese Methode hier besonders aus, obwohl sie mit einer Nachweisgrenze von etwa 5 mM keine hohe Sensitivität besaß, und somit nur Nebenprodukte in höherer Konzentration nachgewiesen werden konnten. $\bullet$ Die nicht kommerziell verfügbaren Metaboliten DAH, DAHP, DHQ, DHS und S3P wurden als Referenzmaterial für die Entwicklung einer intrazellulären Analytik isoliert. Insbesondere für die Entwicklung einer Triple Quadrupol LC–MS basierten Methode musste ein Standard verfügbar sein, da sonst die substanzspezifischen MS/MS Fragmentierungsparameter nicht bestimmt werden konnten. Zur Synthese der benötigten analytischen Standards wurden hauptsächlich genetisch geblockte $\textit{E. coli}$ Mutanten eingesetzt und die Metaboliten aus dem Fermentationsüberstand isoliert. $\bullet$ Unter Verwendung der $^{1}$H–NMR Methode konnten die 3–Dehydroquinat Synthase (AroB), die Shikimat Dehydrogenase (AroE) und die Shikimat Kinase II (AroL) als limitierende Schritte für die L–Phe Biosynthese in $\textit{E. coli}$ L-Phe Produzenten identifiziert werden. Durch die Quantifizierung dieser Nebenprodukte konnten die Metabolitbilanzen (Kohlenstoffbilanz) für die L–Phe Produzenten geschlossen werden, und durch [...] | ||
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