This title appears in the Scientific Report :
2011
NMR solution structures of the MloK1 cyclic nucleotide-gated ion channel binding domain
NMR solution structures of the MloK1 cyclic nucleotide-gated ion channel binding domain
Zyklische Nukleotid-gesteuerte Ionenkanäle spielen eine entscheidende Rolle in der neuronalen Erregbarkeit und in der Signaltransduktion primärer Sinneszellen. Die Kanäle werden durch die Bindung zyklischer Nukleotide an eine intrazelluläre zyklische Nukleotid-Bindedomäne (CNBD) aktiviert. Die direk...
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Personal Name(s): | Schünke, Sven (Corresponding author) |
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Contributing Institute: |
Strukturbiochemie; ICS-6 |
Imprint: |
Jülich
Forschungszentrum Jülich GmbH Zentralbibliothek, Verlag
2011
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Physical Description: |
VI, 91 S. |
Dissertation Note: |
Universität Düsseldorf, Diss., 2011 |
ISBN: |
978-3-89336-722-1 |
Document Type: |
Book Dissertation / PhD Thesis |
Research Program: |
BioSoft: Makromolekulare Systeme und biologische Informationsverarbeitung Funktion und Dysfunktion des Nervensystems |
Series Title: |
Schriften des Forschungszentrums Jülich. Schlüsseltechnologien / Key Technologies
26 |
Subject (ZB): | |
Publikationsportal JuSER |
Zyklische Nukleotid-gesteuerte Ionenkanäle spielen eine entscheidende Rolle in der neuronalen Erregbarkeit und in der Signaltransduktion primärer Sinneszellen. Die Kanäle werden durch die Bindung zyklischer Nukleotide an eine intrazelluläre zyklische Nukleotid-Bindedomäne (CNBD) aktiviert. Die direkte Bindung zyklischer Nukleotide an die CNBD begünstigt die Öffnung des Kanals, vermutlich werden fortlaufende Konformationsänderungen beginnend von der CNBD bis zur Kanalpore übertragen. Der grundlegende Mechanismus der zur Aktivierung des Kanals führt ist weitgehend unbekannt. Um den Mechanismus der Kanalaktivierung verstehen zu können, sind Informationen über die Raumstruktur der CNBD im zyklischen-Nukleotid gebundenen und im freien Zustand nötig. Der K$^{+}$-selektive MloK1 Kanal ist ein Mitglied der zyklischen Nukleotid-gesteuerten Ionenkanäle und wurde in dem Bakterium $\textit{Mesorhizobium loti}$ entdeckt. Der MloK1 Kanal setzt sich aus vier gleichen Untereinheiten zusammen, die zusammen ein Tetramer bilden. Jede Untereinheit enthält sechs Transmembransegmente, eine charakteristische Sequenz für die Selektivität von Kaliumionen und eine C-terminale, intrazellulär vorliegende CNBD. In der vorliegenden Arbeit wurde die Raumstruktur der CNBD des MloK1 Kanals im Komplex mit cAMP mittels mehrdimensionaler NMR-Spektroskopie bestimmt. Die Lösungsstruktur des cAMP-gebundenen Proteins wurde mit einer Präzision von 0.025 nm und 0.068 nm r.m.s.- Abweichung der Proteinrückgrat- und aller Schweratom-Positionen in einer Konformerenschar bestimmt. Ähnlich zu bereits strukturell charakterisierten Bindedomänen für zyklische Nukleotide wie der Proteinkinase A (PKA), dem Katabolit-Aktivatorprotein (CAP) und dem Guaninnukleotid-Austauschfaktor Protein (Epac) besteht die Raumstruktur aus einer $\beta$ Faltblattrolle und einer kurzen internen $\alpha$ Helix. Letztere ist auch bekannt als Phosphatbindekassette (PBC). Über der $\beta$ Faltblattrolle positioniert befinden sich vier zusätzliche $\alpha$ Helices. Ein Teilbereich der $\beta$ Faltblattrolle sowie die Phosphatbindekassette bilden die Bindestelle für zyklische Nukleotide. Dieser Bereich zeigt direkte Wechselwirkungen zum Phosphat und dem Ribosering des zyklischen Nukleotids. Die C-terminale Helix ist über der cAMP-Bindestelle positioniert und stabilisiert diesen Komplex indem die Seitenkette von R348 über der Purinbase liegt und mit dieser interagiert. Bisher war es nicht gelungen die Struktur der wildtyp cAMP-freien CNBD zu lösen. Nach der Proteinexpression liegt die CNBD weitgehend im cAMP-gebundenen Zustand vor und cAMP kann selbst durch intensive Dialyse nicht vom Protein entfernt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher ein Protokoll entwickelt, um cAMP-freies CNBD Protein in ausreichender Menge für NMR-spektroskopische Untersuchungen herzustellen. Der wesentliche Bestandteil des Protokolls ist ein intensiver Waschschritt des Matrix-gebundenen GST-CNBD Fusions-[...] |