Molekularbiologische Charakterisierung, Lokalisation und heterologe Expression von Duftstoffrezeptoren aus männlichen Keimzellen
Molekularbiologische Charakterisierung, Lokalisation und heterologe Expression von Duftstoffrezeptoren aus männlichen Keimzellen
In dieser Arbeit wurden zwei Duftstoffrezeptoren TOR07J und TORK1 aus einer Hoden-cDNA-Bibliothek kloniert. Durch Northern-Blot-Analyse wurde das Transkript von TORK1 in Hoden-RNA nachgewiesen. Mit Hilfe von $\textit{in-situ}$-Hybridisierungsexperimenten ließen sich die Transkripte beider Rezeptoren...
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Personal Name(s): | Kebekus, U. (Corresponding author) |
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Contributing Institute: |
Publikationen vor 2000; PRE-2000; Retrocat |
Imprint: |
Jülich
Forschungszentrum Jülich, Zentralbibliothek, Verlag
1998
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Physical Description: |
VII, 113 p. |
Document Type: |
Report Book |
Research Program: |
Addenda |
Series Title: |
Berichte des Forschungszentrums Jülich
3575 |
Link: |
OpenAccess OpenAccess |
Publikationsportal JuSER |
In dieser Arbeit wurden zwei Duftstoffrezeptoren TOR07J und TORK1 aus einer Hoden-cDNA-Bibliothek kloniert. Durch Northern-Blot-Analyse wurde das Transkript von TORK1 in Hoden-RNA nachgewiesen. Mit Hilfe von $\textit{in-situ}$-Hybridisierungsexperimenten ließen sich die Transkripte beider Rezeptoren in Spermatiden nachweisen. Diese Studien ergaben ferner, daß sich menschliche Spermatiden in ihrem Repertoir an Duftstoffrezeptoren unterscheiden müssen: DasTranskript von TOR07J ist in zwei-bis dreimal mehr Spermatiden vorhanden als das Transkript von TORK1. Der Rezeptor TORK1 wurde in Nierenzellen heterolog exprimiert und über einen Antikörper immuncytochemisch und mit Hilfe von Western-Blot-Analysen nachgewiesen. Durch elektronenmikroskopische Untersuchungen konnte eine Lokalisation des Rezeptors im ER ausgeschlossenwerden, wenn auch aufgrund der schlechten Gewebserhaltung keine Abschätzung der Rezeptordichte in der Plasmamembran möglich war. Versuche, den Rezeptor TORK1 in Nierenzellen funktionell zu exprimieren, verliefen nicht erfolgreich. Als Ligandenquelle wurde Follikelflüssigkeit ausgewählt, da bekannt ist, daß diese das Schwimmverhalten von Spermien ändert und ein chemotaktisches bzw. chemokinetisches Verhalten auslöst. Allerdings stimuliert Follikelflüssigkeit unter den Versuchsbedingungen auch die Wirtszellen. Da der Kopplungspartner von in Keimzellen exprimeren Duftstoffrezeptoren nicht bekannt ist, ließ sich kein Expressionssytem etablieren, welches das Hintergrundsignal zugunsten des Meßsignals unterdrückt hätte. Deshalb rückte die Charakterisierung potentieller Wechselwirkungspartner in den Mittelpunkt meines Interesses. Es gelang erstmals mit Hilfe von $\textit{in-situ}$-Hybridisierung das Transkript eines stimulatorischen G-Proteines in Spermatozyten und Spermatiden nachzuweisen. Western-Blot-Analysen zeigen, daß auch das korrespondierende Protein im Hoden vorliegt. Dies zeigt, daß es in Spermien-Vorläuferzellen einen Signalweg über ein stimulatorisches G-Protein und eine Adenylatzyklase geben muß. Überraschenderweise fand sich auch das Transkript von Zapfentransducin in männlichen Keimzellen, die aber reifer waren als die, die das G$\alpha_{olf}$-Transkript besitzen. Auch Zapfentransducin ließ sich mit Hilfe der Western-Blot-Analyse im Hoden nachweisen. Mit Hilfe von Northern-Blot-Experimenten wurde sowohl die Zapfenphosphodiesterase PDE$\alpha_{cone}$ als auch eine Variante der Guanylatzyklase E (GC-E$_{H}$) detektiert. Letztere scheint gegenüber ihrem retinalen Gegenstück um die extrazelluläre Domäne verkürzt zu sein. Bemühungen, das Guanylatzyklase E-Transkript im Hoden zu lokalisieren, führten noch zu keinem eindeutigen Ergebnis. Jedoch gelang es, das Guanylatzyklase-aktivierende Protein (GCAP) in Spermatiden nachzuweisen. Da als Wechselwirkungspartner für dieses Protein nur eine Guanylatzyklase vom Typ der retinalen Guanylatzyklasen in Frage kommt, ist dies ein starker Hinweis auf die Expressionvon GC-E$_{H}$ in Spermatiden. Zusammenfassend kann man also sagen, daß die physiologische Bedeutung von Duftstoff-rezeptoren in Keimzellen nach wie vor unbekannt ist. Die Kolokalisation von Duftstoffrezeptoren vor allem mit G$\alpha_{olf}$ in Spermatiden legt aber eine parakrine oder autokrine Funktion in deisen Spermatiden nahe. Verschiedene Proteine des cGMP-Stoffwechsels wurden im Hoden sowie GVAP-1 und Zapfentransducin speziell in Spermatiden lokalisiert. Dies deutet daraushin, daß cGMP in diesen Zellen eine ähnlich wichtige Rolle als sekundärer Botenstoff spielt wie cAMP. |